L'électrophorèse

Chez les levures, les plantes et de nombreuses bactéries, les alcool déshydrogénases produisent de l'alcool en générant du NAD+. C'est le processus de fermentation alcoolique, à la base de la biosynthèse de l'éthanol, utilisé dans la production du vin, de la bière, du cidre, ainsi que des agrocarburants.

L’électrophorèse est une tecnhique utilisé pour séparrér et caractérisser des molécules d’un mélange. Elle peut être utiliser dans le contrôle de la puification d’une protéine ce qui est le cas ici.

L’électrophorèse SDS-PAGE, repose comme toute technique électrophorétique, sur

la séparation de molécules sur un gel que l’on soumet a un champ électrique. Une cuve à

électrophorèse est reliée à deux bornes (une cathode (-) et une anode (+))

alimentées par un générateur électrique : les molécules que l’on intercale dans ce

champ migreront, selon leur charge, vers le pôle complémentaire.

Le gel de polyacrylamide est créé par la polymérisation d’acrylamide et de bis-acrylamide, en présence d’agents de polymérisation (TEMED, persulfate d’ammonium par exemple). Plus la concentration en acrylamide est élevée, plus les pores seront petits et plus les molécules seront freinées dans le gel.

Dans l'électrophorèse en conditions non dénaturantes, les molécules sont séparées dans leur état le plus proche possible de leur état natif.

Cela change en condition dénaturantes : de part l'utilisation d'agents dénaturant comme l'urée ou le SDS (sodium dodécyl sulfate). Ce dernier est un détergent très utilisé pour l'électrophorèse de protéines car il possède des caractéristiques particulièrement intéressantes. Non seulement il dénature les protéines, mais il se fixe dessus avec une densité linéaire approximativement constante, c'est à dire que le nombre de molécules de SDS qui se fixe sur une protéine est approximativement proportionnel au nombre d'acides aminés qui la composent, donc à sa masse moléculaire. SDS est une molécule chargée négativement. En sa présence, toutes les protéines vont donc adopter la même forme avec une charge négative proportionnelle à la masse moléculaire.

La forme n'intervient plus (puisque les protéines sont dénaturées) et la charge native non plus (puisque les charges apportées par le SDS sont largement plus nombreuses). La séparation se fait donc uniquement en fonction de la masse moléculaire.

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Autre agent chimique couramment utilisé est le β-mercaptoéthanol. C'est un agent réducteur qui a pour propriété de réduire les ponts disulfures des protéines qui ne sont pas cassés par le SDS.. Cela permet de séparer les différents polypeptides au sein d'une même protéine les rendant ainsi sous forme monomérique. Les sous-unités étant dissociées, sur le gel, apparaitrons après migration, autant de bande qu’il y avait de sous-unités constitutives.La comparaison de SDS-PAGEs avec et sans β-mercaptoéthanol d'un même échantillon est donc riche d'informations sur la structure quaternaires des protéines

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