Approches expérimentales temps retardé en Spectroscopie et Microscopie

Approches expérimentales temps retardé en Spectroscopie et Microscopie

Quelques questions biologiques ?

Localisation / fonctionnement d'organites cellulaires[pic 1]

(noyau, golgi, réticulum, mitochondrie) de protéines particulières d'intérêt

Mesures de

trafic cellulaire proximité spatiale (FRET) dynamique de mouvement

Méthode d'analyse incontournable en biologie

Imagerie par microscopie optique

Nécessite l'utilisation de marqueurs fluorescents

logicielseducatifs.qc.ca

Un problème constant : autofluorescence

Différentes familles de marqueurs fluorescents

[pic 2]

Marqueurs utilisés couramment en biologie : Chromophores organiques, protéiques et nanoparticules[pic 3]

Mais également des lanthanides : Chélates et cryptates

Nanoparticules et applications biologiques

[pic 4]

Thurn KT et al.,[pic 5]

Nanoscale Res Lett 2 (2007) 430-441

Mesure état stationnaire en temps retardé

Etat stationnaire        Echantillon biologique : contient de l'autofluorescence (dont l'intensité peut varier suivant l'état de l'échantillon, problèmes de corrections)

Rend difficile les détections et quantifications de structures d'intérêt

Durée de vie fluorescence composés organiques < 100 ns Lanthanides > 1 ms Temps retardé        [pic 6][pic 7][pic 8]

(Time-GatedDécalage temporel entre excitation Luminescence, TGL)et acquisition de la fluorescence

On n'acquiert que la fluorescence des espèces à durée de vie longue

Séparation temporelle de signaux de fluorescence

Décalage temporel entre excitation et acquisition[pic 9]

Gudgin Dickson EF et al.,

J. Photochem Photobiol B 27 (1995) 3-19

Seules les fluorescences des lanthanides seront enregistrées

Simplification des spectres de fluorescence

Meilleur contraste des images

Approches expérimentales temps retardé à L'IPBS

Spectroscopie cuve et Microspectrofluorimétrie (MSF)

[pic 11]

Imagerie microscope champ large

Microscope champ large Obj x63 projectif x1.6[pic 12]

Source excitatrice lampe Hg

Filtres Ex 365 nm Em LP 400 nm

Détection caméra EM CCD

Dénombrement de particules

Montage système mesure temps retardé (MSF)

[pic 13]

Mesures sur mélange fluorophores organique et Eu3+

Spectres du mélange pour Intensités fonction retard différentes valeurs de retard et ratio % Eu dans les spectres

[pic 14]

Le décalage temporel augmente la contribution de l'Eu mais on est à la limite de résolution du détecteur

        Imagerie Multi Photon        Excitation 720 nm, Obj x40 W

Détection spectrale résolution 5 nm

        Spectre des particules de l'image        Image d'une solution de particules Eu3+

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