TP électrophorèse De Protéines électrotransfert Et Immunorévélation

Compte rendu TP électrophorèse de protéines électrotransfert et immunorévélation

I) But du TP

Lors du premier TP, nous avions essayé de purifier une protéine du blanc d’œuf, le lysozyme, par chromatographie échangeuse d’ions. Dans ce TP, nous allons vérifier cette purification à l’aide d’une électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Puis afin d’identifier précisément l’enzyme nous effectuerons un électro-transfert suivi d’une immunorévélation.

II) Principe

A°) Electrophorèse

L’électrophorèse est une méthode d’analyse et de séparation basée sur la migration différentielle de particules chargées sous l’influence d’un champ électrique continu. La migration se fait au sein d’une phase liquide imprégnant un solide poreux ou un gel. Ainsi, les molécules chargées positivement migrent vers la cathode (chargée négativement) et celles chargées négativement vont vers l’anode (positive). On aboutit alors à la séparation des fractions protéiques sous forme de zones distinctes.

Ici, on utilise le gel de polyacrylamide en milieu dénaturant (en présence de SDS). L’électrophores se compose de deux étapes :

1-Dénaturation des protéines à chaud à 95°C puis en présence de SDS :

Les molécules seront séparées ici seulement en fonction de leur masse moléculaire grâce à la méthode SDS-PAGE. Le SDS (sodium dodécylsulfate) est un détergent

anionique CH3(CH2)10CH2OSO3-, qui se lie fortement aux protéines et les dénature en les chargeant négativement (les protéines perdent leur structure tridimensionnel (dépliement) puis se chargent négativement (macropolyanions)).

2- Migration des protéines dans le gel :

Les protéines, chargées négativement, migrent vers l’anode (pole +), mais à des

vitesses différentes. Le gel de polyacrylamide est finement réticulé et à une structure poreuse. Il résulte de la polymérisation d’acrylamide CH2=CHCONH2 et de bis-acrylamide (CH2=CHC0NH)2CH2 en présence de catalyseurs : la polymérisation est initiée par une réaction radicalaire : le persulfate d’ammonium (APS) S2082- et TEMED (CH3)2N-CH2-CH2-N(CH3)2 stabilise le radical SO4-* :

S2082- + e- TEMED S042- + S04-*

La taille des mailles du gel est fonction de la concentration en acrylamide. Plus la concentration est élevée, plus les mailles sont petites, et plus les grosses protéines sont retenues. Le gel se conduit alors comme un tamis moléculaire : les macromolécules migrent d'autant moins vite qu'elles sont grosses.

Ainsi les protéines migrent vers l’anode selon une relation linéaire impliquant log (Poids Moléculaire = PM) en fonction de la mobilité relative des protéines : il est par conséquent possible de calibrer les distances de migration avec des marqueurs de PM connus et ainsi de déterminer le PM d’une protéine inconnue. La dénaturation provoquée par le SDS ne suffit pas à rompre les ponts disulfures. En revanche, un tel traitement en présence de s-mercaptoéthanol (agent réducteur) permet de rompre ces ponts disulfures qui généralement lient les différentes sous-unités d'un complexe constitué de plusieurs protéines.

L’électrophorèse SDS-PAGE est souvent complétée d’un gel de concentration et d’un système à tampon discontinu, qui permettent d’obtenir une plus grande résolution. Le gel est constitué d'une zone dite de « séparation », dont la concentration en polyacrylamide est choisie en fonction de la taille des protéines à séparer, précédée par une zone de "concentration" de l'échantillon. Le gel de concentration, caractérisé par une porosité supérieure, est placé au- dessus du gel de séparation. Il permet de concentrer les protéines sur une même ligne qui sera le point de départ de l’électrophorèse. Ainsi, les distances de migration sont déterminées avec plus de précision.

Les bandes protéiques obtenues après électrophorèse sur le gel de polyacrylamide sont généralement révélées par des colorants. On utilisera ici un colorant non spécifique et irréversible : le Bleu de Coomassie (fixant toutes les protéines qui apparaissent ainsi bleues).

L’électrophorèse va nous permettre de vérifier la pureté du lysozyme, et de déterminer les poids moléculaires du lysozyme et d’une protéine inconnue (ici l’alcool déshydrogénase).

B°) Electro-transfert

L’électro-transfert consiste à mettre en contact le gel de l’électrophorèse avec un support (membrane de cellulose) imprégné de tampon d’électro-transfert. En appliquant un courant continu, nous allons réaliser une seconde électrophorèse qui va permettre le transfert des protéines du gel sur la membrane.

Cette méthode permet de vérifier l’identité du lysozyme, c'est-à-dire de démontrer que nous avons bien purifié le lysozyme et non une autre protéine.

C°) Immuno-révélation

Nous procédons ensuite à la révélation par coloration au Rouge Ponceau dans un premier temps qui est un colorant réversible & spécifique des protéines, puis par immuno-révélation, appelée également ≪ Western blot ≫. Notons que cette étape de révélation se fait après avoir préalablement saturé la membrane de nitrocellulose avec du TBS tween (tampon détergent) afin d’éviter les interactions non spécifiques.

Le TBS lait permet ensuite de bloquer les sites libres de la membrane : les protéines du lait (ex : la caséine) remplissent les sites libres, et l’excédent de lait est enlevé par le TBS tween.

Grâce à cette méthode, les protéines seront révélées spécifiquement par l’action d’un anticorps. On utilisera ici une solution d’anticorps anti-lysozyme couplés à une peroxydase : l’anticorps se liant spécifiquement au lysozyme. La révélation se fera par l’ajout à la peroxydase d’un substrat incolore dont le produit apparait coloré permettant ainsi la révélation de la protéine d’intérêt : le lysozyme.

III) Résultats et interprétation

A°) Electrophorèse sur gel de polyacrylamide

1-Préparation des échantillons

Dénomination M1 ADH M2 ADH F1 F2 E2

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