La lactate déshydrogénase, purification partielle par chromatographie d’affinité
TD : La lactate déshydrogénase, purification partielle par chromatographie d’affinité. Recherche parmi 299 000+ dissertationsPar karimene • 3 Décembre 2014 • TD • 343 Mots (2 Pages) • 815 Vues
LDH COMPTE RENDU N°1, ENZYMOLOGIE :
La lactate déshydrogénase, purification partielle par chromatographie d’affinité
But : Purifier la lactate déshydrogénase.
Nous disposons d’un extrait de tissubovin fœtal.
Purification partielle sur gel de bleu de Cibacron et mesure de l’activité enzymatique
1ère étape : Vérifier la présence de l’enzyme dans notre tissu.
Réaction d’oxydation dulactate (dans les mitochondries) :
Lactate + NAD + Pyruvate + NADH,H+
Si notre enzyme est présente, la réaction va s’effectuer et la concentration en NADH, H+ va augmenterau cours du temps. Nous mesurons l’absorbance du NADH, H+ à 340 nm.
En effet, l’absorbance est proportionnellement liée à la concentration d’après la loi de Beer lambert :
A = £ . l . c
Sil’absorbance augmente alors la concentration en NADH,H+ augmente .
Cette première étape correspond à notre première mesure, nous mettons en présence le substrat ( Lactate + NAD+) et l’extrait ( LDHsupposée présente ).
Le résultat nous montre une croissance de l’absorbance, pente= 0.44
Il y a formation de NADH, H+, la réaction s’effectue, notre enzyme est présente dans notre extrait.
2me étape :chromatographie, lavagede la colonne après passage de l’extrait
Nous faisons passer notre extrait au travers d’une colonne contenant du bleu de Cibacron.
Ce colorant présente des moléculesanalogues au coenzyme NAD+. Elles vont se fixer à l’enzyme en prenant la place du le ligand qui ne peut alors plus se lier, la réaction ne se réalise pas et les enzymes sont retenus dans la colonne.Nous vérifions qu’il n’y a pas présence de l’enzyme dans la fraction non retenue (récupération de l’extrait passé à travers la colonne) et dans la fraction de lavage (courbe 2 et 3)
L’absorbance estconstante, il n’y a pas présence de l’enzyme pour ces deux fractions.
3ème étape : chromatographie, élution de la colonne
Nous procédons ensuite à l’élution de la colonne pour... [à continuer]
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(2013, 11). TP d'enzymologie LDH. Etudier.com. Récupérée 11, 2013, à partir de http://www.etudier.com/dissertations/Tp-d%27Enzymologie-Ldh/44737315.html
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